2018年9月4日 星期二

如何用Scimage手顯拍攝"暗視野"

暗視野(Dark fileld),主要是去除觀測物以外的直射光線進入鏡頭,以周遭側向的光來呈現觀測物,讓背景黑、主體亮,形成反差,表現主體。

以Scimage的超物手持示範如下,光源在鏡頭對向,利用鏡頭--觀察物--光源的相對位置差,即可看出亮視野(Bright field)與暗視野的差異。

有關Scimage手顯的各種模式,請參考http://tcc-tjj.blogspot.com/2017/07/blog-post.html


圓葉狸藻花,鏡頭--觀察物--光源接近直線

圓葉狸藻花,鏡頭--光源錯位

  
而運用於顯微鏡的話,就是要製造出類似的光線條件。

若使用顯微鏡觀察暗視野,因為光線對比增加,可以觀察到4~200nm的微粒子,解析度會比亮視野高出許多。
一般標準顯微鏡的作法是要有一個遮住正中心光源的遮片,讓中心觀察體的區域不能直接受光,由遮光片旁邊入光觀察。

而使用Scimage科學maker的手顯來看的話,十分容易。

特別適合觀察視野內的獨立觀察物,尤其在觀察水中微生物,細節微妙,更是神奇!


以亮視野及暗視野觀察前管蟲

不過,可以的話,除了必備的手顯之外,一開始請先準備兩件事。

一、會使用手機的相機的亮暗(光圈)控制。像iphone就是按螢幕久一點,出現方框(顯示)自動對焦鎖定,上下滑滑就可。Android手機則請使用手動方式來調整光圈。


iphone手機的鎖焦控制光圈

二、可以加工一下光源。由於led光源射出本身的面積較廣,操作時容易不小心閃到鏡頭。建議可以用黑吸管、膠帶等小物,把光源包起約束。
這點在使用標準正立時差異不大,但若要在沒有第二點所述的小半球鏡頭,於通用模組下拍攝暗視野,就會有別。


約束光線,讓光線集中

好,進入正題。

以Scimage社團的手顯觀察暗視野,基本上有兩個方式。

一、讓光線在觀測體斜下方,不要射到鏡頭,但要斜照到觀察體。

可以用無影手,也就是手拿著燈,尋找最佳的角度。


無影手

或像是螢光模組打光的方式,將led折彎,第三螺桿鎖上H版,將燈靠近載物台(用中空載物台最好,沒有也可)下方,慢慢側向調整尋找最佳的角度。
這個方法,有一點耐心,在標準正立的狀態下都可完成。

架設H板放燈

微調位置

無影手使用通用模組時的狀態

以無影手使用通用模組20X看海棗切片

以小半球使用通用模組20X看海棗切片


二、要先取得小半球鏡頭(請小小努力集點),貼於載物台下。

這個方式是以小半球鏡頭聚光,將led燈往外移動微調,光線透過小半球鏡頭折射,會形成中間無直射光的雙邊側光,構成暗視野條件。


燈與鏡頭同軸,光線集中在中心區
中間為光線檢測玻片

移動燈源,光線透過小半球形成雙向側光

沒有小半球移動光源的光況

操作方式是慢慢向外微調光源到被攝主體呈現暈暴光的狀態,縮光圈到背景近黑,主體還夠光。然後再微調光源位置到影像對比最好的狀態,就成功了。示範影片如下



調光三階段示意圖

以最適合暗視野的水中微生物來展示調光

這個方式是大多使用在通用物鏡模組4X、10X、20X物鏡時,到若到40X物鏡以上,會有光線的限制,很難成功。


什麼物件適合使用暗視野觀察呢?


就個人經驗來說,薄的、有透度(非透明)的立體物件最適合,像是水中的微生物和藻類、昆蟲的鱗片、切片或是苔都是很好的測試對象。





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觀察環境裡的事物,也不適合太複雜,高低起伏太多。否則很容易被周遭物件擋住光,或反光。尤其是有厚度的物件,更是會大大地妨礙。

觀察體旁有較高物件,產生反光,造成背景的陰陽海

不要大片範圍佔滿觀察視野,若能有clear shot(周遭無其他物件),就更加完美。



顏色的話,個人經驗則以綠色最為突出。






若要以手持方式拍攝,可將手顯鏡頭取下,加工裝至手持夾。
 

依循正立顯微鏡上方打光的金相,下方斜打光的暗視野方式,也可以順利完成 !
 
水苔,金相

水苔,金相

水苔,暗視野

水苔,暗視野

不同光線角度的暗視野

Scimage手顯的小半球暗視野不同於標準顯微鏡的暗視野。是利用光線經由小半球折射,所產生的雙向側光(一強一弱)。

這樣的光線有基本的方向性,在觀察時可以利用這個特性,旋轉物體(玻片)來看不同面向的效果。(社團手顯的載台螺絲距比玻片小,旋轉時卡到的話,拿起玻片換個位置再續轉即可)

當暗視野光線軸與馬尾毛平行時,可以最大呈現馬尾毛表面。在垂直時,小半球的雙向強弱斜光顯現出來,一邊是邊光,另邊卻光線過強,必須縮光圈才不會有圖片過曝的狀況。

以下9張圖,為同一光線角度及強度下(除第7張縮光比較),觀察咖啡色馬尾毛







縮光調整前一cut的過亮




待續..